Опыт лечения бесплодия методом эко и пэ по абсолютным показаниям за бюджетные средства. Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и перенос эмбриона (ПЭ) в матку Трансвагинальная пункция фолликулов и получение преовуляторных ооцитов при ЭКО

1. Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО).
2. Перенесение гамет, эмбрионов в маточные трубы (ГИФТ,ЗИФТ).
3. Микроманипуляции на гаметах при лечении мужского бесплодия:
частичное рассечение зоны блестящей оболочки;
субзональное оплодотворение;
интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИЦИС).
4. Вспомогательные методы репродукции с помощью донорских ооцитов и эмбрионов.
5. Суррогатное материнство (женщина-донор вынашивает генетического ребенка семьи-заказчика).
6. Криоконсервация сперматозоидов, яйцеклеток и эмбрионов.
7. Искусственная инсеминация спермой мужа или донора (ИСМ, ИСД).

ОБОСНОВАНИЕ

Частота бесплодных браков в России превышает 15%, что, по данным ВОЗ, считают критическим уровнем. В стране зарегистрировано более 5 млн бесплодных супружеских пар, из них более половины нуждаются в использовании методов ВРТ. По экспертной оценке, показатель только женского бесплодия за последние 5 лет увеличился на 14%.

Основой для развития целого ряда подходов, которые в настоящее время объединены общим термином ВРТ, стал классический метод ЭКО и ПЭ в полость матки. При этом ооциты после культивирования в специальной питательной среде оплодотворяют спермой, которую предварительно центрифугируют и обрабатывают в питательной среде.

Виды ВРТ:

• вынашивание эмбриона женщинойдобровольцем («суррогатное» материнство) для последующей передачи ребенка (детей) генетическим родителям;
• донорство ооцитов и эмбрионов;
• ИКСИ;
• криоконсервация ооцитов и эмбрионов;
• преимплантационная диагностика наследственных заболеваний;
• редукция эмбрионов при многоплодной беременности;
• собственно ЭКО и ПЭ.

ЭКО используют в мировой практике терапии бесплодия с 1978 г. В России данный метод впервые успешно реализован в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, где в 1986 г. благодаря работам профессора Б.В. Леонова родился первый ребенок «из пробирки». Разработка метода ЭКО вывела проблему лечения трубного бесплодия из тупика и позволила добиться наступления беременности у огромного числа женщин, ранее обречённых на бездетность.

По отношению к пациентам программы ЭКО необходимо, чтобы речь шла о бесплодии супружеской пары в целом. Это принципиально меняет подход к отбору пациентов и их подготовке к программе - делает обязательной предварительную оценку состояния репродуктивной системы как женщин, так и мужчин.

Приблизительно 40% случаев бесплодия среди супружеских пар обусловлено мужским бесплодием. Метод ИКСИ позволяет иметь потомство мужчинам с тяжелыми формами бесплодия (олиго, астено, тератозооспермиями тяжелых степеней), иногда лишь при наличии единичных сперматозоидов в пунктате, полученном при биопсии яичка. ЭКО с использованием ооцитов донора применяют для преодоления бесплодия в тех случаях, когда у женщины невозможно получить собственные ооциты или получают некачественные ооциты, не способные к оплодотворению и развитию полноценной беременности.

Программа «суррогатного» материнства - единственный метод получения генетически своего ребенка для женщин с отсутствующей маткой или с выраженной экстрагенитальной патологией, когда вынашивание беременности невозможно или противопоказано.

Преимплантационную диагностику также основывают на методе ЭКО. Её цель - получение эмбриона на ранних стадиях преимплантационного развития, обследование его на генетическую патологию и ПЭ в полость матки. Операцию редукции выполняют при наличии более трёх эмбрионов. Это - вынужденная процедура, но необходимая для успешного течения многоплодной беременности. Рациональное и научно обоснованное применение редукции, а также совершенствование техники её выполнения при многоплодной беременности позволяет оптимизировать клиническое течение такой беременности, прогнозировать рождение здорового потомства и снизить частоту перинатальных потерь.

*Инсеминация спермой мужа (ИСМ)

Инсеминация спермой мужа (ИСМ) - перенесение а) во вла-галище и шейку матки небольшого количества свежей спермы или б) непосредственно в полость матки спермиев, приготовленных в лабораторных условиях методом всплывания или фильтрации через градиент Перколла. ИСМ производится в тех случаях, когда женщина полностью здорова и трубы проходимы.

Показания к использованию ИСМ:

♦ невозможность влагалищной эякуляции (психогенная или органическая импотенция, тяжелая гипоспадия, ретроградная эякуляция, влагалищная дисфункция);
♦ мужской фактор бесплодия - дефицит количества (оли-госпермия), подвижности (астеноспермия) или нарушение структуры (тератоспермия) спермиев;
♦ неблагоприятный цервикальный фактор, который не-возможно преодолеть традиционным лечением;
♦ использование криоконсервированных спермиев для индукции беременности (сперму получают до начала лечения рака или вазектомии).

Эффективность процедуры при ИСМ - 20 %.

Инсеминация спермой донора (ИСД)

Используют размороженную криоконсервированную сперму донора. ИСД проводится при неэффективности спермы мужа или если не удается преодолеть барьер несовместимости. Техника ИСМ и ИСД одинакова.

Эффективность ИСД - 50 % (максимальное число циклов, в которых целесообразно предпринимать попытки - 4).

ГИФТ - перенос яйцеклетки вместе со сперматозоидами в маточные трубы. У женщины берут одну или несколько яйцеклеток, у мужа - сперму, смешивают и вводят их в маточную трубу.

ЗИФТ - перенос эмбриона (зиготы) в маточные трубы.
При ЗИФТе вероятность наступления беременности существенно выше, чем при ГИФТе. ГИФТ и ЗИФТ могут быть выполнены как во время лапароскопии, так и под УЗ контролем.

В первом случае гаметы или зиготы вводят в трубу со стороны брюшной полости, во втором - через шейку матки. ГИФТ и ЗИФТ совмещают с диагностической лапароскопией и проводят однократно. Эффективность до 30 %.

Оплодотворение in vitro (ОИВ) - процесс смешивания ооцита и спермия в лабораторных условиях. Стимуляция яичников контролируется с помощью измерения уровня эстрадиола в плазме крови и УЗ-измерения роста фолликулов. Проводят пункцию фолликулов и аспирацию их содержимого. Полученные ооциты инкубируют с капацитированными спермиями мужа, затем образовавшиеся эмбрионы переносят в полость матки между 2 и 6 днем после пункции фолликулов, как это происходит в случае природного оплодотворения.

Показания для проведения ОИВ:
♦ необратимые повреждения маточных труб в результате воспалительного процесса или при хирургическом вмешательстве;
♦ мужское бесплодие;
♦ иммунологическое бесплодие;
♦ бесплодие при эндометриозе;
♦ бесплодие неясного генеза.

Метод ЭКО с использованием донорских эмбрионов

Применяется у женщин с нефункционирующими яичниками (при «раннем климаксе» или после их удаления). Сущность метода: пациентке переносят эмбрион, образовавшийся в результате оплодотворения донорской яйцеклетки спермой мужа. Иногда с этой целью вместо яйцеклеток используют донорские эмбрионы. В последующем проводится ЗГТ, имитирующая состояние женщины при обычной физиологической беременности.

Суррогатное материнство

Такой вид ЭКО проводится у больных без матки. Сущность метода: полученную у женщины яйцеклетку инсеменируют спермой мужа, а затем переносят образовавшийся эмбрион в матку другой женщины - «суррогатной» матери, согласившейся вынашивать ребенка и после родов отдать его «хозяйке» яйцеклеток, т.е. генетической матери.

Замораживание сперматозоидов и эмбрионов

Преимущества метода:
♦ возможность использовать сперму в любое время и в любом месте;
♦ осуществление контроля доноров в отношении зара-женности их спермы вирусом СПИДа, что исключает опасность инфицирования как женщины, так и плода;
♦ возможность использования эмбрионов в циклах, последующих за неудачной попыткой ЭКО, если яйцеклеток и эмбрионов было получено больше, чем это необходимо для переноса (обычно - более 3-4).

ЦЕЛЬ ВРТ

Получение здорового потомства у бесплодных супружеских пар.

ПОКАЗАНИЯ ВРТ

• абсолютное трубное бесплодие при отсутствии маточных труб или их непроходимости;
• бесплодие неясного генеза;
• бесплодие, не поддающееся терапии, или бесплодие, вероятность преодоления которого с помощью ЭКО выше, чем при использовании других методов;
• иммунологические формы бесплодия (наличие антиспермальных АТ по МАР–тесту ≥50%);
• различные формы мужского бесплодия (олиго, астено или тератозооспермии), требующие применения метода ИКСИ;
• СПКЯ;
• эндометриоз.

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ ВРТ

• врождённые пороки развития или приобретённые деформации полости матки, при которых невозможна имплантация эмбрионов или вынашивание беременности;
• доброкачественные опухоли матки, требующие оперативного лечения;
• злокачественные новообразования любой локализации (в том числе в анамнезе);
• опухоли яичников;
• острые воспалительные заболевания любой локализации;
• соматические и психические заболевания, которые противопоказаны для вынашивания беременности и родов.

ПОДГОТОВКА К ПРОВЕДЕНИЮ ВРТ

Объём обследования супружеской пары перед проведением ЭКО регламентирован приказом Министерства здравоохранения РФ от 26 февраля 2003 г. № 67 «О применении ВРТ в терапии женского и мужского бесплодия».

Для женщины обязательны:

• заключение терапевта о состоянии здоровья и возможности вынашивания беременности;
• исследование на микрофлору из уретры и цервикального канала и степень чистоты влагалища;
• клинический анализ крови, включая определение времени свёртывания крови (действителен 1 мес);
• общее и специальное гинекологическое обследование;
• определение группы крови и резусфактора;
• УЗИ органов малого таза.

По показаниям дополнительно проводят:

• бактериологическое исследование материала из уретры и цервикального канала;
• биопсию эндометрия;
• инфекционное обследование (хламидии, уреаплазма, микоплазма, ВПГ, ЦМВ, токсоплазма, вирус краснухи);
• исследование состояния матки и маточных труб (ГСГ или гистеросальпингоскопия и лапароскопия);
• обследование на наличие антиспермальных и антифосфолипидных АТ;
• определение в плазме крови концентраций ФСГ, ЛГ, эстрадиола, пролактина, тестостерона, кортизола, прогестерона, гормонов щитовидной железы, ТТГ, СТГ;
• цитологическое исследование мазков шейки матки.

При необходимости назначают консультации у других специалистов.

Для мужчины обязательны:

• анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С (действителен 3 мес);
• спермограмма. По показаниям проводят:
• инфекционное обследование (хламидии, уреаплазма, микоплазма, ВПГ, ЦМВ);
• FISHдиагностика сперматозоидов (метод флуоресцентной гибридизации in situ);
• определение группы крови и резусфактора.

Также назначают консультацию у андролога. Для супружеской пары старше 35 лет необходимо медикогенетическое консультирование.

МЕТОДИКА ВРТ

Процедура ЭКО состоит из следующих этапов:

• отбор, обследование и при обнаружении отклонений - предварительная подготовка пациентов;
• стимуляция суперовуляции (контролируемая овариальная стимуляция), включая мониторинг фолликулогенеза и развития эндометрия;
• пункция фолликулов яичников с целью получения преовуляторных ооцитов;
• инсеминация ооцитов и культивирование развившихся в результате оплодотворения эмбрионов in vitro;
• ПЭ в полость матки;
• поддержка периода после ПЭ;
• диагностика беременности на ранних сроках.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВРТ

По данным Европейской ассоциации репродуктологов в Европе на сегодняшний день проводят более 290 000 циклов ВРТ в год, из них 25,5% заканчиваются родами; в США - более 110 000 циклов в год с частотой наступления беременности в среднем 32,5%.

В клиниках России ВРТ проводят 10 000 циклов в год, при этом частота наступления беременности составляет около 26%.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВРТ

Развитие фармакологической промышленности привело к созданию новых препаратов для стимуляции фолликулогенеза, новых одноразовых пункционных игл для получения ооцитов, а также современных атравматичных катетеров для ПЭ в полость матки. Это позволило извлекать большее количество ооцитов хорошего качества, снизить риск возможных осложнений при проведении ТВП и, соответственно, повысить эффективность программы ЭКО до 36–39% из расчета на один ПЭ в полость матки.

В программе ЭКО и ПЭ наиболее эффективна схема стимуляции суперовуляции препаратами рекомбинантных гонадотропинов на фоне десенситизации репродуктивной системы ГнРГ. С нашей точки зрения, применение схем стимуляции суперовуляции с использованием препаратов рекомбинантных гонадотропинов и антагонистов ГнРГ менее эффективно, однако позволяет снизить частоту развития СГЯ почти в 2 раза.

Применение метода ИКСИ у супружеских пар с двумя и более неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе при нормальных показателях сперматогенеза и нарушенной репродуктивной функцией у женщины позволяет добиться наступления беременности в 52% случаев.

Биопсия яичка и/или придатка яичка с последующим гистологическим исследованием в сочетании с гормональным и генетическим скринингом у пациентов с азооспермией позволяет установить диагноз и определить дальнейшую тактику лечения бесплодия супружеской пары. Группа пациентов с необструктивной формой азооспермии прогностически самая неблагоприятная в плане получения сперматозоидов и наступления беременности в программе ЭКО/ИКСИ. Частота наступления беременности у этой группы пациентов составляет 14,3%.

Криоконсервацию во ВРТ сегодня применяют практически для любых видов биологических материалов. Этот метод позволяет длительно хранить сперму, тестикулярную ткань, ооциты и эмбрионы. После оттаивания жизнеспособны 95% сперматозоидов, 80% эмбрионов. При отмене процедуры ПЭ в стимулированном цикле изза высокого риска развития СГЯ и при криоконсервации всех эмбрионов «хорошего» качества частота наступления беременности у пациенток составляет 37,1% из расчёта на цикл стимуляции. Эффективность применения размороженных после криоконсервации бластоцист в программах ВРТ у женщин с неудачной попыткой составила 29,5%.

Пренатальная диагностика в программах ЭКО и ПЭ снизила частоту возникновения спонтанных абортов до 13% у семейных пар, где один из родителей - носитель хромосомной аберрации, по сравнению с частотой спонтанных абортов у пациентов с аналогичными проблемами, не воспользовавшихся услугами пренатальной диагностики. Выявление хромосомной патологии у эмбрионов и перенос только генетически нормальных эмбрионов повышает процент имплантации, уменьшает риск спонтанного аборта и предупреждает рождение ребенка с генетической патологией у пациентов программы ЭКО. С помощью пренатальной диагностики можно избежать хромосомных заболеваний, сцепленных с полом плода (гемофилии А и В, миопатии Дюшена, синдрома Мартина–Белла и др.), трисомии по 21й хромосоме (синдром Дауна), 13й хромосоме (синдром Патау), 18й хромосоме (синдром Эдвардса), моносомии (Шерешевского–Тернера) и др.

Пренатальная диагностика показана в случае рождения детей с наследственной и врождённой патологией в анамнезе, присутствия в кариотипе сбалансированных хромосомных аберраций, двух и более неудачных попыток ЭКО в анамнезе, пузырного заноса в анамнезе, повышенного процента сперматозоидов с анеуплоидией разных хромосом (по Х, Y хромосомам >0,25%) в эякуляте супруга, при возрасте женщины старше 35 лет, для определения пола плода. Точность определения пола эмбриона этим методом составляет 95–97%. Частота наступления беременности после применения пренатальной диагностики в ФГУ «НЦ АГиП Росмедтехнологий» в отделении ВРТ в 2006 г. составила 32%.

Операция редукции эмбрионов позволяет снизить частоту осложнений многоплодной беременности, так как риск невынашивания и рождения глубоко недоношенных детей при вынашивании тройни достигает 70%. Впервые редукцию многоплодной беременности в I триместре осуществили с применением трансцервикального доступа и удалением нижележащего плодного яйца. Метод оказался чрезвычайно травматичным и сопровождался большим числом осложнений, поэтому не нашел применения в практике. В настоящее время используют трансабдоминальный или трансвагинальный доступ.

При трансвагинальном доступе внутриматочное вмешательство осуществляют специально маркированной иглой через задний или передний своды влагалища. Для визуального контроля за продвижением иглы используют специальные биопсийные адаптеры, позволяющие с высокой точностью визуализировать перемещение иглы в полости матки.

Для редукции эмбрионов через трансабдоминальный доступ используют датчик, применяющийся для трансабдоминального сканирования, снабжённый биопсийным адаптером, и иглу длиной 15 см, с эхогенной поверхностью в 1 см на дистальном конце, снабжённую самофиксирующимся мандреном.

При выполнении редукции обоими методами электронную маркировку датчика направляют в область грудной клетки эмбриона и иглу быстрым движением вводят в полость плодного яйца, контролируя точность манипуляций по видеоизображению на экране монитора аппарата ультразвуковой диагностики. Глубину проникновения иглы контролируют визуально. После проникновения в полость плодного яйца наконечник иглы подводят к грудной клетке редуцируемого эмбриона и механически разрушают органы грудной клетки до остановки сердечной деятельности. В случае сохранения сердцебиений у редуцируемого эмбриона проводят повторную редукцию через 2–4 дня.

ОСЛОЖНЕНИЯ ВРТ

• аллергические реакции на препараты для стимуляции овуляции;
• воспалительные процессы;
• кровотечение;
• многоплодная беременность;
• СГЯ, возникающий, как правило, после ПЭ, - ятрогенное состояние, характеризующееся увеличением размеров яичников и формированием в них кист. Это состояние сопровождается повышением сосудистой проницаемости, гиповолемией, гемоконцентрацией, гиперкоагуляцией, асцитом, гидротораксом и гидроперикардом, электролитным дисбалансом, увеличением концентрации эстрадиола и онкомаркера СА125 в плазме крови (подробнее в разделе «Синдром гиперстимуляции яичников»);
• эктопическая внематочная беременность. Частота возникновения внематочной беременности при использовании ВРТ колеблется от 3% до 5 %.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии. Сущность способа прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ: в фолликулярной жидкости определяют содержание ФНО- и -ФРФ. Рассчитывают прогностический индекс (ПИ) по формуле: ПИ=0,0027·X+Y·(+8,9626·10 -7 ·Y-3,0827·10 -6 ·X)-0,1448, где Х - количество ФНО-, Y - количество -ФРФ. Получение результата меньше, чем 0,3038 свидетельствует о благоприятном прогнозе для оплодотворения in-vitro. При значении равном или большем, чем 0,3038 прогнозируют неблагоприятный исход оплодотворения in-vitro. Способ позволяет повысить точность и информативность прогноза программы ЭКО и ПЭ.

(56) (продолжение):

CLASS="b560m"FASOULIOTIS SJ et al. Maternal serum levels of interferon-gamma and interleukin-2 soluble receptor-alpha predict the outcome of early IVF pregnancies. Hum Reprod. 2004, 19(6), p. 1357-63, реф.

DRIANCOURT MA et al. Control of oocyte growth and maturation by follicular cells and molecules present in follicular fluid. A review. Reprod Nutr Dev. 1998, 38(4), p. 345-62, реф.

MCNATTY KP et al. Control of early ovarian follicular development. J Reprod Fertil Suppl. 1999, 54, p. 3-16, реф.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и найдет применение для прогнозирования оплодотворения in-vitro с целью повышения эффективности метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКОиПЭ).

Проблема лечения бесплодия в настоящее время приобретает не только медицинское, социально-демографическое, но и экономическое значение (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2004). Частота бесплодия в России составляет 10-15%, а в некоторых регионах превышает 15%-ный уровень, определенный проблемной группой ВОЗ как критический, влияющий на демографические показатели (Кулаков В.И., 1999). Сегодня все большее распространение в нашей стране и во всем мире получает метод лечения бесплодия путем экстракорпорального оплодотворения и переноса дробящихся эмбрионов в полость матки пациентки. Если в 1987-1990 эффективность метода составляла 10-15% на один перенос эмбриона, то в настоящее время этот показатель увеличился до 25-35% случаев. Вместе с тем, в клиниках, применяющих метод ЭКО и ПЭ, продолжается поиск новых подходов повышения эффективности метода.

Программа ЭКО и ПЭ сложна в связи с тем, что она многоэтапная, но не все этапы можно объективно проконтролировать. В известной мере часть неудачных исходов ЭКО заложена в самой природе репродуктивного процесса человека, составляющего около 20% для супружеской пары в возрасте 20 лет (Никитин А.И.,1995). В связи с этим возникла идея стимуляции суперовуляции с целью получения большего числа яйцеклеток за счет применения гонадотропинов. Однако увеличение количества яйцеклеток влечет за собой другой отрицательный фактор - некоторые из них могут оказаться неполноценными, с нарушением оогенеза или хромосомной патологией, а другие могут стать на путь обратного развития в процессе фолликулогенеза. С целью улучшения качества ооцитов и предотвращения преждевременного их созревания за счет выброса эндогенного лютеинизирующего гормона в схему стимуляции суперовуляции включают агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (Fleming R. et al., 1990).

Весьма важным фактором для исхода ЭКО является состояние мужских половых клеток. В то же время значительный прогресс, связанный с внедрением в практику метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, позволяет иметь потомство мужчинам с тяжелыми формами заболеваний, ранее обреченным на абсолютное бесплодие (Леонов с соавт., 1999).

Готовность эндометрия - важнейшее условие успешной имплантации перенесенного в матку эмбриона (Tabibzadeh S. et al., 1995). При подозрении на наличие нарушений циклической трансформации эндометрия ряд авторов рекомендуют проводить предварительную терапию лекарственными средствами, содержащими прогестерон и эстрадиол (Ffrindler S. et al., 1992).

Очень важным фактором, влияющим на успешность имплантации эмбриона, является процесс его переноса в матку (Tomar et al., 2002). Но в настоящее время существуют различные типы катетеров, обеспечивающие проведение данной процедуры атравматично (Mansour R.T. et al., 2002). Кроме этого, проведение гистерскопии до проведения программы ЭКО позволяет оценить состояние стенок цервикального канала, эндометрия и в случаях наличия патологии произвести соответствующие оперативные вмешательства.

Существенным моментом, оказывающим влияние на успех имплантации эмбриона, является возраст женщины. Однако учитывая использование донорских ооцитов, частота успешных результатов программы ЭКО и ПЭ не различается у пациенток раннего и позднего репродуктивного возраста (Craft J., 1990).

Особое внимание следует уделить инфекционной заболеваемости, поражающей половую систему, что может приводить к нарушению оплодотворения in-vitro и наступлению беременности, препятствовать рождению здорового потомства (Steyaert С.R., et al., 2000). Поэтому существенным моментом в реализации программы ЭКО и ПЭ является своевременное выявление и лечение у супружеской пары инфекций, тесно связанных с репродуктивной системой, входящих в так называемый TORCH-комплекс (токсаплазмоз, краснуха, цитомегаловирусная и герпетическая инфекции, хламидиоз, сифилис, гепатиты А и В, гонококковая инфекция, листериоз) (Кузьмичев Л.Н., 1998).

Определяющим фактором положительного результата программы ЭКО и ПЭ является состояние эмбриона, которое определяет успешность имплантации П (Lenz J.V. et al., 1996). В то же время для того чтобы получить эмбрионы хорошего качества, необходимо, чтобы развитие преовуляторного ооцита не было нарушено в условиях оплодотворения in-vitro.

Исследования последних лет подтверждают гипотезу о том, что множество иммуноактивных цитокинов участвуют в процессах имплантации и плацентарного развития. Изменение материнского Т-хелперного (Th) клеточного ответа, необходимого для наступления нормальной беременности резко изменяется от реакции Thi- к Тh2-типа. Напротив, персистенция ответа Тh1-типа характерна для нарушения течения беременности ранних сроков (Hill J.A. et al., 1995). Это мнение поддерживается многими клиническими исследованиями (Marzi M. et al., 1996; Raghupathy R. et al., 2000; Makhseed M. et al., 2001), в которых убедительно показано, что повышение продукции периферическими лимфоцитами Th1 цитокинов наблюдается у женщин с неблагоприятными результатами программы ЭКО и ПЭ, в отличие от доминирования Th2 реакции, характерной для нормально протекающей беременности.

В то же время получены данные, свидетельствующие о том, что цитокины, в особенности факторы роста, содержащиеся в фолликулярной жидкости, являются важными модуляторами внутриовариальных процессов, регулирующими развития ооцита (Kane M.T. Morgan P.M. Coonan С. Peptide growth factors and preimplantation development// Hum. Reprod. Upd.- 1997-Vol.3 - 137-157).

Сниженное содержание инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в фолликулярной жидкости было выявлено в группе бесплодных пациенток, имеющих эндометриоз, дисфункцию яичников и низкие результаты программы ЭКО и ПЭ (Cunha-Filho J.S.L., Lemos N.A., Freitas F.M., Kiefer K, Faller M.,Passos E.P. // Insulin-like growth factor (IGF)-l and IGF binding protein-1 and -3 in the follicular fluid of infertile patients with endometriosis Hum. Reprod.- 2003-18-423-428).

Некоторые исследователи связывают сниженные концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) в фолликулярной жидкости с получением ооцитов и эмбрионов более высокого качества, увеличением частоты наступления беременности (Friedman C.I., Seifer D.B., Kennard E.A., et al.. Elevated level of follicular fluid vascular endothelial growth factor is a marker of diminished pregnancy potential // Fertil. Steril. - 1998-70-836-839; Barroso G., Barrionuevo M., Rao P. et al Vascular endothelial growth factor, nitric oxide, and leptin follicular fluid levels correlate negatively with embryo quality in IVF patients// Fertil. Steril.-1999-V.72-P.1024-1026).

Известно, что более высокие концентрации трансформирующего фактора роста (ТФР- b1) в фолликулярной жидкости достоверно связаны с успешным преэмбриональным развитием, повышенными уровнями имплантации эмбрионов и наступления беременности (van Rooij I.A.J., M.Broekmans F.J., te Velde E.R. Serum anti-Mullerian hormone levels: a novel measure of ovarian reserve// Hum. Reprod.- 2002-17-3065-3071).

Hammadeh M. E. и соавт. (2002) не обнаружили значимых изменений в концентрации колониестимулирующего фактора роста в фолликулярной жидкости при сравнительном изучении пациенток с различными факторами бесплодия (трубным, эндометриозом, бесплодием неясного генеза и мужским фактором) (Hammaden M.E., Ertan A.K., Zeppezauer M. et al.Immunoglobulins and Cytokines Level in Follicular Fluid in Relation to Etiology of Infertility and their.//AJRI 2002-47-82-90).

Однако общими недостатками перечисленных выше работ является: проведение определений факторов роста в фолликулярной жидкости в группах пациенток с различными этиологическими факторами женского и мужского бесплодия, иными словами, отсутствуют критерии включения и исключения в группы исследования по этиологическому принципу. В работах также отсутствует информация о показаниях к проведению программы ЭКО и ПЭ. Также существенным недостатком перечисленных выше работ следует признать отсутствие сведений о содержании факторов роста в фолликулярной жидкости в случаях остановки оплодотворения ооцитов или эмбрионов.

Таким образом, на сегодняшний день накоплены определенные сведения, свидетельствующие о возможном прогнозировании результатов программы ЭКО и ПЭ на основании определения содержания факторов роста в фолликулярной жидкости.

В то же время известно о том, что в группе пациенток с трубным бесплодием при проведении программы ЭКО отсутствие оплодотворения яйцеклеток in-vitro отмечается в 9% случаев, а остановка развития эмбриона в 8,4% случаев (Witkin, S.S et al., 1996). При этом следует особо подчеркнуть, что в России для абсолютного большинства пациенток основным показанием для программы ЭКО и ПЭ является трубное бесплодие.

В связи с чем необходима дальнейшая разработка способов, позволяющих проводить прогнозирование оплодотворения in-vitro, причем в первую очередь для данной категории пациенток, что является особенно актуальным в случаях применения дорогостоящих методов лечения бесплодии, к которым относится ЭКО и ПЭ.

Прототипом изобретения выбран способ оценки развития ооцитов путем исследования маркеров в фолликулярной жидкости, полученной во время пункции фолликулов и аспирации их содержимого при проведении программы ЭКО и ПЭ, с целью определения исходов программы. Сущность данного исследования заключается в том, что в фолликуллярной жидкости определяют более высокие уровни инсулиноподобного фактора роста (ИФР) и низкие интерлейкина-1, что свидетельствуют о благоприятном прогнозе для наступления беременности. (Mendoza С., Ruiz-Requena E., Ortega E., Cremades N., Martinez F., Bemabeu R., Greco, E., Tesarik, J.Follicular fluid markers ofoocyte developmental potential.// Hum. Reprod.-2002-17- 1017-1022).

Недостатками прототипа являются: во-первых, отсутствие четких критериев, при каких значениях исследуемых маркеров следует думать о неблагоприятном исходе программы ЭКО, что снижает точность и информативность данного способа; во-вторых, данное исследование проведено в группе пациенток без патологии со стороны репродуктивной системы, показанием для проведения программы ЭКО был мужской фактор бесплодия, в связи с чем оплодотворение in-vitro осуществлялось с помощью интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида, в то время как основными показаниями к проведению программы экстракорпорального оплодотворения является трубное бесплодие; в-третьих, отсутствуют сведения о пациентках, которым перенос эмбрионов не производился в связи с нарушенным оплодотворением in-vitro.

Указанные недостатки устраняются в предлагаемом изобретении. Задача изобретения - повышение точности способа и его информативности.

Поставленная задача решается тем, что после проведения пункции фолликулов, аспирации их содержимого и выделения ооцитов проводится определение средних концентраций ФНО- и -ФРФ. Прогностический индекс (ПИ) получается при расчете формулы: ПИ=0,0027·Х+Y·(+8,9626·10 -7 ·Y-3,0827·10 -6 ·Х)0,1448, где Х- ФНО-, Y- -ФРФ. Значение ПИ равное или больше, чем 0,3038 свидетельствует о том, что оплодотворения in-vitro будет нарушено. Достоверность полученной формулы - P-value: 2,299e-8

Технический результат, получаемый в результате проведения прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ данным способом, заключается в том, что:

1) существенно повышается точность и информативность прогноза исходов программы ЭКО и ПЭ на ранних этапах ее выполнения;

2) можно провести исследование полученного материала во время пункции (фолликулярную жидкость и клеток, содержащихся в ней) с целью своевременного обследования пациентки;

3) повышается результативность следующих программ ЭКО с помощью проведения этиотропной терапии пациентки с учетом результатов обследования;

4) можно принять своевременное решение об интрацитоплазматической инъекции сперматозоида с целью улучшение результата оплодотворения in-vitro;

5) снижается психологическая нагрузка на пациентку, ожидающую информацию о результатах оплодотворения in-vitro и дне переноса эмбрионов вследствие раннего предупреждения о возможном неблагоприятном исходе оплодотворения.

6) снижается лекарственная нагрузка на пациентку за счет исключения ее из программы ЭКО и ПЭ.

Критерием успеха одного из наиболее важных этапов программы ЭКО является получение эмбрионов хорошего качества. В то же время развитие эмбриона in-vitro напрямую связано с состоянием ооцита и интровариальными процессами, обеспечивающими его развитие, которые происходят, как было отмечено выше, при непосредственном участии факторов роста, определение содержания в фолликулярной жидкости которых может способствовать прогнозированию исходов программы ЭКО и ПЭ на ранних этапах ее проведения.

С целью разработки способа прогнозирования результатов программы ЭКО и ПЭ нами было проведено исследование содержания в фолликулярной жидкости факторов роста - ФНО- и -ФРФ в 637 фолликулах у 75 пациенток с трубным фактором бесплодия, обратившихся в Ростовский НИИ акушерства и педиатрии. Из 36 пациенток (1 группа) оплодотворение in-vitro было нарушено на этапе развития яйцеклеток в 61,2% (22) случаев, а на этапе развития эмбрионов в 38,8% (14). Перенос эмбрионов в данной группе не проводился. Во вторую группу исследования были включены 39 пациенток, у которых оплодотворения in-vitro протекало нормально и закончилось переносом эмбрионов. Прогностическая формула (ПИ) была получена на основании сравнительного анализа средних концентраций ФНО- и -ФРФ в группах пациенток с произошедшим оплодотворением in-vitro и с отсутствием оплодотворения in-vitro. Математический анализ проводился с помощью программного обеспечения PolyAnalist 3.5 (Megaputer Intelligence).

Анализ научно-медицинской и патентной литературы позволил установить, что изучению нарушений оплодотворения in-vitro посвящены лишь единичные исследования, сводящиеся к определению неблагоприятного влияния жидкости, содержащейся внутри гидросальпинкса, на развитие и имплантацию эмбриона в эксперименте (Arrighi C.V. et aL, 2001, Carrasco I.et al., 2001, Ajonuma L.C. et al., 2003). В других работах нарушение оплодотворения при культивировании ооцитов связывают с клеточными или генетическими нарушениями, которые называют «фактор ооцита», причем, как подчеркивают сами авторы, данные выводы требуют дальнейшего уточнения (Levran D. et al., 2002).

В то же время большинство пациенток, страдающих трубным бесплодием, имеют хронический воспалительный процесс, который вызывает у них спаечную болезнь органов малого таза. Спайки органов малого таза могут быть последствием реконструктивно-пластической хирургии или тубэктомии. Назначение гонадотропинов во время контролируемой стимуляции суперовуляции может быть одним из факторов, способствующих обострению хронического воспалительного процесса придатков матки, что ведет к появлению клеточных и плазменных медиаторов воспалительного процесса - цитокинов, к которым относятся факторы роста ФНО- и -ФРФ.

ФНО- и -ФРФ, содержащиеся в фолликулярной жидкости, могут быть секретированы клетками гранулезы и лейкоцитами: В-лимфоцитами, моноцитами, естественными киллерами, количество которых увеличено при воспалительных заболеваниях органов малого таза. Теоретически, они также могут попадать в фолликулы из перитонеальной жидкости за счет диффузии через овариальную капсулу в случаях воспалительного процесса органов малого таза, однако эти данные в настоящее время в литературе отсутствуют. Вместе с тем исследование Cheong Y.C. с соавт. (2002) свидетельствует о высоких концентрациях ФНО- в перитонеальной жидкости при спаечной болезни органов малого таза, что может также оказывать негативное влияния на процессы оогенеза. Факторы роста могут оказывать действие на клетки фолликула различными путями: аутокринным, паракринным, интракринным и эндокринным (Mandrup-Poulsen Т. et al., 1995; Vinatier D. et al., 1995). ФНО- может вызвать снижение функции яичников на фоне воспалительного процесса в связи ингибированием стимулируемого гонадотропином стероидогенеза в недифференцированных овариальных клетках вследствие снижения секреции аденилилциклазы и ц-АТФ (Terranova P.F., Rice V.M., 1997). Кроме этого, повышенные концентрации ФНО- в фолликулярной жидкости приводят к апоптозу (Matsubara H. et al, 2000).

В настоящее время получены данные, свидетельствующие о ингибировании продукции эстрогенов ФНО- (Pottratz S.T. et al., 1994). Более того, установлено, что ФНО- ингибирует продукцию прогестерона желтым телом и вызывает атрезию фолликула (Buscher U. et al., 1999, Nash M. A.et al., 1999; Yeh J. and Adashi E.Y., 1999; Doraiswamy V. et al, 2000). Увеличение концентрации ФНО- в фолликулярной жидкости может отрицательно влиять на овуляцию и на оплодотворение in-vitro (Cianci A. et al., 1996) и оказывать эмбриотоксический эффект (Sung L. et al., 1997). С другой стороны, известно, что яичник является органом с чрезвычайно высоким уровнем ангиогенеза (Redmer, D.A. and Reynolds, L.P., 1996) и рост сосудистой части тека-ткани фолликулов регулируется -ФРФ (Schams D. et al., 1996). Существует также гипотеза, что низкие уровни эстрогенов в сыворотке крови, недостаточные для пролиферации клеток, зависят от различных факторов роста, в том числе от -ФРФ (Hermenegildo С., Сапо А., 2000). Имеются также сведения о важном значении -ФРФ для предимлантационного развития эмбриона (Chai N. et al., 1998).

Проведенные исследования позволили установить зависимость между концентрациями ФНО- и -ФРФ в фолликулярной жидкости и оплодотворением in-vitro. Определение содержания указанных факторов роста позволяет прогнозировать результат оплодотворения in-vitro на ранних этапах проведения программы ЭКО и ПЭ.

Подробное описание способа и примеры его конкретного применения.

Для реализации способа используют следующую аппаратуру: стандартный набор оборудования и оснащения для лабораторий ЭКО и ПЭ, фотометр (Victor, 1420 Multilabel counter, Wallac, Финляндия). Уровень концентраций в фолликулярной жидкости цитокинов определяли с помощью коммерческих тест-систем ФНО- (CytElisa) и -ФРФ (ACCUCYTE) (CYTIMMUNE, Science INC., США).

Стимуляция суперовуляции проводится по «короткому протоколу» с использованием аналога гонадолиберина (Диферелин, Бофур Ипсен) в ежедневной дозе 0,1 мг, который назначается в первый день менструального цикла после ультразвукового исследования. На следующий день начинают стимуляцию фолликулогенеза введением препаратов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (Пурегон, Органон) в суточной дозе 150-250 ME. Стимуляция проводят до дня достижения лидирующими фолликулами диаметра 18 мм, определяемого при трансвагинальной эхографии, после чего назначают инъекцию «овуляторной дозы» хорионического гонадотропина (Прегнил, Органон).

Через 35-36 часов после инъекции хорионического гонадотропина проводится трансвагинальная пункция фолликулов и аспирация преовуляторных ооцитов. Трансвагинальная пункция производится в гинекологическом кресле с помощью ультразвукового аппарата «ALOKA SAL500» (Япония). Промежность и влагалище дезинфицируются. Пациентку укрывают простынями, оставляя открытой промежность. С помощью влагалищного датчика с установленной на нем специальной насадкой для пункционной иглы проводится ультразвуковое исследование органов малого таза для выбора оптимальной позиции расположения пункционной траектории. После определения правильного направления пункционной траектории через просвет насадки влагалищного ультразвукового датчика проводится пункция содержимого фолликулов с помощью иглы. Аспирация содержимого фолликулов производится с использованием вакуум-отсоса, под давлением 80 мм рт.ст., обеспечивающим поступление аспирата в стерильные пробирки. Полученную фолликулярную жидкость передают эмбриологу для идентификации и выделения из нее ооцитов. Подготовка спермы проводится с использованием методики swim-up в среде Mtdium B1 (CCD, Франция). Аспирированные ооциты инсеминируются и культивируются в среде В2 INRA MEDIUM (CCD, Франция). Образцы фолликулярной жидкости центрифугируются при скорости 400 g в течение 10 минут и чистая фракция используется для определения в ней ФНО- и -ФРФ. Методика определения ФНО- и -ФРФ описана в инструкции производителя коммерческого набора.

Полученные значения ФНО- и -ФРФ подставляются в формулу расчета ПИ=0,0027·X+Y·(+8,9626·10 -7 ·Y-3,0827·10 -6 ·X)-0,1448, где Х - ФНО-, Y - -ФРФ, и если значение ПИ равное или больше, чем 0,3038, то прогнозируют неблагоприятный исход ЭКО и ПЭ, что является показанием для исключения женщины из программы и направление ее на дополнительное обследование.

Приводим клинические примеры, подтверждающие работоспособность способа.

Пациентка П-ва Л.В., 35 лет, история болезни №582/60, дата пункции фолликулов 14.06.01.

Диагноз: Хронический двухсторонний сальпингит. Состояние после сальпингоовариолизиса, сальпингостомии. Синдром Фитц-Хью-Куртиса. Вторичное бесплодие.

Средние концентрации составили ФНО-=20,5 пг/мл, -ФРФ=167,5 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ=-0,0501, что свидетельствовало о благоприятном исходе ЭКО. В результате культивирования ооцитов in-vitro были получены эмбрионы и осуществлен их перенос.

Пациентка Ч-ва Н.В. 28 лет, история болезни №4094/441, дата пункции фолликулов 19.06.02г.

Средние концентрации составили ФНО-=315,1 пг/мл, -ФРФ=1210,0 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ = 1,1933, что свидетельствовало о неблагоприятном исходе ЭКО. В результате культивирования ооцитов оплодотворение in-vitro не произошло, эмбрионы получены не были.

Пациентка Ш-к И.В., 33 года, история болезни №2529/286, дата пункции фолликулов 13.04.02 г.

Диагноз: Состояние после 2-сторонней тубэктомии. Спаечная болезнь органов малого таза. Вторичное бесплодие.

Средние концентрации составили ФНО-=87,0 пг/мл, -ФРФ=482,3 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ = 0,3038, что свидетельствовало о неблагоприятном исходе ЭКО и ПЭ. В результате культивирования ооцитов оплодотворение in-vitro не произошло, эмбрионы получены не были.

По материалам заявляемого способа прогнозирования программы ЭКО и ПЭ нами обследовано 152 пациентки, обратившихся для проведения экстракорпорального оплодотворения по поводу трубного бесплодия в Ростовский НИИ акушерства и педиатрии. Возраст обследованных больных колебался от 24 до 36 лет, в среднем составляя 29,4±2,2 года. Из них у 59% диагностировано первичное бесплодие, у 41%-вторичное. Длительность бесплодия варьировало от 6 до 14 лет, составляя в среднем 7,4±2,1 года. У 11 пациенток значения ПИ составили более 0,3038, оплодотворение in-vitro в этих случаях не произошло, что послужило основаниям для проведения их дальнейшего обследования. У остальных пациенток значения ПИ составили менее 0,3038, оплодотворение in-vitro в этих случаях произошло и им был произведен перенос эмбрионов.

Заявляемый метод основан на использовании стандартного лабораторного оборудования, не требует технической модификации. Использование данной методики позволяет врачу в первые сутки культивирования ооцитов предсказать результат оплодотворения с целью разработки дальнейшей тактики ведения пациентки и проведения дополнительных лабораторных исследований с целью уточнения причин нарушения оплодотворения. Заявленный способ может использоваться в гинекологических стационарах, использующих программу ЭКО и ПЭ.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ прогнозирования исхода программы ЭКО и ПЭ путем исследования фолликулярной жидкости, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости проводят количественное определение содержания ФНО- и -ФРФ, рассчитывают прогностический индекс (ПИ) по формуле

ПИ=0,0027·Х+Y·(+8,9626·10 -7 ·Y-3,0827·10 -6 ·Х)-0,1448,

где Х - количество ФНО-, Y - количество -ФРФ, и при значении ПИ, меньшем, чем 0,3038, прогнозируют благоприятный исход оплодотворения in-vitro, а при значении, равном или большем, чем 0,3038, прогнозируют неблагоприятный исход оплодотворения in-vitro.

При недостаточном для проведения ИИСМ ко­личестве сперматозоидов или при
отсутствии эф­фекта от ВМИ в течение нескольких циклов может быть проведено ЭКО, когда
сперматозоиды опло­дотворяют ооцит вне организма — in vitro , или «в
пробирке».

Вначале метод ЭКО и ПЭ применялся преиму­щественно при бесплодии,
обусловленном непрохо­димостью маточных труб или их отсутствием. В та­ких случаях метод
предусматривает получение яйце­клеток из яичника женщины, оплодотворение их in vitro и перенос
эмбриона в полость матки после не­скольких его дроблений в пробирке. Метод разрабо­тан Р. Эдвардсом и
П. Стептоу (Англия, 1978) и на­зван ими in vitro fertilization and miotransfer (IVF&ET).

Процедура ЭКО состоит из следующих этапов:

• отбор и обследование пациентов;
• индукция суперовуляции, включая мониторинг фолликулогенеза и развития эндометрия;
• пункция фолликулов яичников;
• инсеминация ооцитов и культивирование эмб­рионов in vitro ;
• перенос эмбрионов в полость матки;
• поддержка лютеиновой фазы стимулирован­ного менструального цикла; S диагностика беременности на
  ранних сроках.

Последние 15 лет внимание специалистов, рабо­тающих в программе ЭКО и ПЭ, привлечено к
схе­мам стимуляции суперовуляции с использованием агонистов гонадотропего-рилизинг-гормона (а-ГнРГ),
которые представляют собой группу синтетических соединений, сходных с естественным ГнРГ.

В соответствии с двухфазностью действия а-ГнРГ в программе ЭКО и ПЭ используют две
принципи­альные схемы стимуляции суперовуляции.

При так называемой «короткой» схеме введение а-ГнРГ и ЧМГ (ФСГ) начинают в ранней
фоллику-линовой фазе одновременно или ЧМГ (ФСГ) на­значают через 2—3 дня после первого введения а-ГнРГ
— в фазу активации аденогипофиза. Блокада функциональной активности аденогипофиза возни­кает уже
после начала стимуляции суперовуляции. Так, декапептил в ежедневной дозе 0,1 мг вводят подкожно со
второго дня менструального цикла до назначения овуляторной дозы ХГ. Стимуляцию су­перовуляции ЧМГ
начинают с пятого дня менстру­ального цикла с 2—3 ампул ЧМГ (75 ME— 225 ME) и проводят с соблюдением
критериев УЗИ и гормо­нального мониторинга до дня введения ХГ.

При использовании длинной схемы, считающей­ся «золотым стандартом», введение
а-ГнРГ начина­ют в ранней фолликулиновой или в середине лютеи­новой фазы цикла, предшествующего
стимуляции суперовуляции. Могут применяться а-ГнРГ как для ежедневного введения, так и депонированные
фор­мы. Большинство клиницистов предпочитают еже­дневные подкожные инъекции а-ГнРГ, так как они
более экономичны, имеют высокую клиническую эффективность и хорошо переносятся.

Сейчас чаще всего для достижения блокады функциональной активности аденогипофиза
ис­пользуют декапептил или диферелин для ежедневно­го подкожного введения в дозе 0,1 мг и
депо-дека-пептил для внутримышечного введения в дозе 3,75 мг, а в качестве стимулятора суперовуляции
— препара­ты ЧМГ и рекомбинантный ФСГ.

Через 10—17 дней от первого введения а-ГнРГ в результате снижения рецепторов ГнРГ в
клетках аденогипофиза (десенситизация) уровень гонадо-тропинов в плазме крови снижается до базального
(соответственно происходит блокада гонад) и пре­кращается спонтанное развитие фолликулов в
яич­никах.

Стимуляцию препаратами ЧМГ (ФСГ) начина­ют только после достижения блокады
секретор­ной активности аденогипофиза и вторично — яич­ников.

Критерии начала стимуляции суперовуляции в «длинных» схемах с использованием
а-ГнРГ и ЧМГ (ФСГ):

• снижение концентрации Е 2 в плазме крови до 30—50% от исходного уровня (менее 100 пмол/л или 30
  пг/мл);
• толщина эндометрия не более 5 мм.

Стимуляцию суперовуляции в схемах с исполь­зованием а-ГнРГ следует
проводить с обязательным использованием УЗИ и гормонального мониторинга независимо от формы введения
препарата и фазы менструального цикла, в которой оно начато.

Ежедневную дозу ЧМГ (ФСГ) в первые пять дней стимуляции определяют с учетом количества
фолликулов, полученных при предшествующих по­пытках ЭКО и ПЭ, и, как правило, она не превы­шает 2-3
ампул ЧМГ (ФСГ) (150 ME- 225 ME) в день до дня введения овуляторной дозы ХГ.

Определение времени введения овуляторной дозы ХГ — также один из ключевых моментов
про­ведения программы ЭКО и ПЭ. Овуляторная доза ХГ назначается после достижения уровня Е 2 в
плаз­ме крови не менее 1000 пмол/л (300 пг/мл) из рас­чета на каждый лидирующий фолликул, при разме­рах
лидирующих фолликулов 18—20 мм и толщине эндометрия не менее 9 мм. При наличии в одном или обоих яичниках
1—5 фолликулов овуляторная доза ХГ составляет обычно 5 тыс. MEХГ, если име­ется более 10 фолликулов
— 10 тыс. MEХГ. В каждом случае овуляторная доза ХГ определяется индивидуально.

При рассмотрении схем стимуляции суперовуля­ции нельзя и не упомянуть об антагонистах
ГнРГ. Использование антагонистов ГнРГ в схемах стиму­ляции суперовуляции в программе ЭКО и ПЭ имеет ряд
преимуществ перед применением а-ГнРГ: бло­када гонадотропной активности аденогипофиза воз­никает в
течение нескольких часов, без предшеству­ющей фазы активации; возможно не только предотвращение, но и
прекращение уже начавшегося «па­разитарного» пика ЛГ в период стимуляции; требу­ется
меньшее количество препаратов ЧМГ, ФСГ и их комбинаций; реже возникает СГЯ; почти вдвое сокращается
продолжительность лечения.

Антагонисты назначают по 0,25 мг или по 3,0 мг подкожно на 6—7-й день стимуляции
суперовуля­ции или при диаметре лидирующего фолликула 14 мм в течение 4—5 дней.

Назначение овуляторной дозы ХГ осуществляет­ся по описанным выше критериям, доза
подбирает­ся индивидуально. Через 35—36 часов производится трансвагинальная пункция фолликулов в
целях аспирации фолликулярной жидкости и получения преовуляторных ооцитов.

Метод культивирования преовуляторных ооци­тов состоит из нескольких этапов.

1. Забор ооцитов. Полученную фолликулярную жидкость эмбриолог анализирует на
   предмет поиска ооцитов на стереомикроскопе. Найденные ооциты последовательно промывают в среде для
   промывки ооцитов и помещают в С0 2 -инкубатор в среде для культивирования.
2. Подготовка сперматозоидов. Из полученной спермы выделяют фракцию наиболее
   подвиж­ных сперматозоидов путем центрифугирования в градиенте плотности либо методом свободного
   всплытия.

Оплодотворение. В случае ЭКО: ооциты пере­носят в среду
оплодотворения, содержащую пред­варительно выделенные наиболее подвижные спер­матозоиды, и
помещают в С0 2 -инкубатор. В случае ИКСИ: ооциты очищаются от кумулисных клеток и инъектируются
сперматозоидами.

1. Оценка оплодотворения. Культивирование. Че­рез 16—18 часов с момента
   оплодотворения ооциты оценивают на предмет выявления признаков нор­мального оплодотворения. Аномально
   оплодотво­ренные ооциты уничтожают, нормально оплодо­творенные — переносят в среду
   культивирования и помещают в С0 2 -инкубатор, где инкубируют до переноса в полость матки. Среды
   культивирования меняют согласно протоколу культивирования, при­нятому лабораторией.
2. Перенос эмбрионов. Перенос эмбрионов осу­ществляется на третьи либо пятые
   сутки культиви­рования (считая оценку оплодотворения — первыми сутками культивирования). Для
   переноса эмбрионы в среде для переноса помещают в катетер, который передают гинекологу.

Эмбрионы, полученные после оплодотворения ооцитов одной и той же пациентки, как правило,
отличаются по скорости дробления и морфологиче­ским параметрам. Качество дробления эмбрионов
оценивается по количеству и размеру бластомеров, по наличию и количеству фрагментации.

Качество эмбрионов, достигших стадии развития бластоцисты, оценивается по количеству и
размеру клеток трофектодермы, по наличию и качеству вну­триклеточной массы, по объему полости и толщине
зоны пелюцида.

Количество переносимых эмбрионов, как прави­ло, составляет не более двух, поскольку при
увеличении числа эмбрионов увеличивается риск моногоплодной беременности, что влечет за собой серьезные
проблемы акушерского и социального характера.

Возможные осложнения после ЭКО те же, что и после ВМИ, плюс возможность наружного и
внут­реннего кровотечения.

Программа ЭКО — эффективный метод восста­новления фертильности у пар с
мужским фактором бесплодия при получении от 500 тыс. до 1 млн быстроподвижных сперматозоидов и более 5% их
мор­фологически нормальных форм после обработки спермы в градиенте плотности. При этом показатель
оплодотворения ооцитов — в среднем 70—80%, бе­ременностей на стимулированный цикл — около 30%,
родов — около 20% (табл. 26).

Доказаны следующие противопоказания к ис­пользованию метода ЭКО и ПЭ:

Абсолютные:

• - злокачественные новообразования любой ло­кализации, в том числе в анамнезе.

Относительные:

• - соматические и психические заболевания, яв­ляющиеся противопоказаниями для вынаши­вания
  беременности и родов; опухоли яич­ников;
• - доброкачественные опухоли матки, требую­щие оперативного лечения;
• - острые воспалительные заболевания любой локализации.

В.К. Чайка, В.В. Луцик, И.К. Акимова, М.В. Попова
Донецкий региональный центр охраны материнства и детства

Вступление

Бесплодие - одна из самих актуальных проблем современной гинекологии. Несмотря на существенный прогресс в лечении бесплодия, не отмечается тенденция к снижению его частоты .

Проблема охраны репродуктивного здоровья населения Украины в настоящее время приобрела особую социальную значимость. Важным фактором, снижающим репродуктивный потенциал населения страны, является бесплодие в браке у 25% супружеских пар . У большинства женщин оно обусловлено непроходимостью маточных труб или их отсутствием. Все большее распространение при лечении бесплодия получает метод экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ) . Эффективность ЭКО равна или превышает таковую в естественных условиях и составляет 35%.

Согласно приказу МОЗ Украины от 29.11.2004 г. № 579 "Про затвердження Порядку направлення жінок для проведення першого курсу лікування безплідності методами допоміжних репродуктивних технологій за абсолютними показаннями за бюджетні кошти", отделение диагностики и лечения бесплодного брака (ОДЛББ) Донецкого регионального центра охраны материнства и детства (ДРЦОМД) является базой для проведения одной попытки лечения бесплодия у женщин методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) по абсолютным показаниям за бюджетные средства.

Первый курс лечения бесплодия методами ВРТ проводится женщинам в возрасте 19-40 лет. Абсолютными показаниями для лечения являются: 1) нормогонадотропное бесплодие трубного происхождения: отсутствие или полная непроходимость обеих маточных труб; 2) суррогатное материнство при условии вынашивания беременности кровной родней: сестрой или матерью больной, у которой бесплодие маточного происхождения, связанное с отсутствием матки, аномалиями развития матки, синехиями в полости матки.

Все пациентки с бесплодием были обследованы по месту жительства согласно предписанию МЗО Украины от 11.10.2005 г. № 4.40-1004. Обследование женщин включало в себя: 1) группа, резус крови; 2) общий анализ крови; 3) общий анализ мочи; 4) коагулограмма; 5) биохимия крови; 6) анализ выделений из влагалища; 7) цитологическое исследование из шейки матки; 8) анализ на TORCH-инфекции; 9) RW; 10) ВИЧ; 11) антитела к вирусу гепатита В; 12) антиген к вирусу гепатита С; 13) гормональное обследование: ЛГ, ФСГ, эстрадиол на 2-3 день менструального цикла, тестостерон, пролактин, кортизол; 14) генетическое обследование; 15) осмотр специалистов (эндокринолог, психиатр, терапевт, инфекционист). Обследование мужчин: 1) генетическое обследование; 2) спермограмма; 3) RW; 4) ВИЧ.

Несмотря на большой перечень обследований и тщательный отбор, предусмотренные приказом № 579, пациенты нередко прибывают для лечения неподготовленными и недообследованными. В частности, с полипами шейки матки и полипами эндометрия, кистами яичника, гидро- и сактосальпинксами, повышенным уровнем тестостерона, кортизола. Эти пациенты требуют проведения подготовительного лечения, включающего гормональную терапию, иногда оперативного лечения.

За 2006 год нами проведено 345 циклов стимуляции суперовуляции с последующей пункцией фолликулов и переноса эмбрионов. Возрастной состав женщин выглядит следующим образом: 19-25 лет - 78 (22,6%); 26-30 лет - 114 (33,0%); 31-35 лет - 124 (36,0%); 36-40 лет - 29 (8,4%). Средний возраст пациенток составил 31,3 года, длительность бесплодия - в среднем 7,6 года.

Лечение получили женщины различных регионов Украины представленные в таблице 1.

Всем пациенткам проводили стимуляцию суперовуляции на фоне применения агонистов гонадотропин-релизинг гормона (ГнРГ) по длинному протоколу. Для десенситизации (18-22 день менструального цикла) применялся препарат диферелин 3,75 мг. Стимуляция суперовуляции проводилась препаратом Пурегон 50 МЕ, активным веществом которого является фолитропин-бета (рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон, ФСГ). Число ампул, рекомендуемое МОЗ Украины на цикл стимуляции - 40.

На сегодняшний день, основным и единственным показанием для включения пациентов в программу ЭКО с ПЭ за бюджетные средства, является отсутствие или непроходимость маточных труб. Если речь идет только о трубном бесплодии, то такой набор медикаментов может быть и обоснован. Однако, эндокринный фактор бесплодия, в большей или меньшей степени, присутствует практически у каждой больной.

Кроме этого, целому ряду пациенток в возрасте после 30 лет, с оперированными яичниками, "плохим ответчикам", не подходит длинный протокол стимуляции. Им предпочтительней использовать короткий протокол, для которого необходимы агонисты релизинг-гормонов короткого действия, а их нет.

Нами проводился ультразвуковой и гормональный мониторинг зреющих фолликулов. При достижении доминантными фолликулами размеров 18-20 мм вводилась овуляторная доза хорионического гонадотропина (ХГ). В данном случае внутримышечно вводился препарат Прегнил 10 ТЕ. С помощью трансвагинальной пункции аспирировали фолликулы. Культивирование ооцитов проводили по стандартной методике в среде Menezo В2.

Основные показатели стимуляции суперовуляции у женщин с абсолютными показаниями представлены в таблице 2.

Перенос эмбрионов проводили на 2-3 сутки после пункции. В полость матки пациентки переносили не более 3 нормальных эмбрионов. Поддержку лютеиновой фазы проводили по стандартной схеме с использованием прогестерона, утрожестана или дуфастона.

При неадекватной стимуляции суперовуляции и вследствие различной чувствительности рецепторного аппарата яичников к вводимым препаратам, а следовательно, и различной реакции яичников, увеличивается риск развития серьезного осложнения - синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) .

В литературе встречаются различные данные о частоте СГЯ, что обусловлено применением различных схем стимуляции суперовуляции и различных методов диагностики и профилактики этого осложнения . В среднем, по данным литературы, частота СГЯ колеблется в пределах от 8 до 23%. СГЯ средней степени составляет 1-7%, тяжелой - 1-1,8% на стимулированный цикл .

У 51 (14,8%) пролеченных нами женщин развился СГЯ. Из них: у 30 (8,7%) СГЯ легкой степени и у 21 (6,1%) СГЯ средней степени.

У женщин с легкой формой СГЯ уровень эстрадиола в среднем составлял 2050 pg/mL. При ультразвуковом исследовании диагностированы увеличенные до 6,0 см в диаметре яичники.

При средней степени СГЯ уровень эстрадиола в среднем составлял 4250 pg/m; яичники были увеличены до 6-10 см в диаметре; увеличение и напряжение живота, явные признаки асцита при ультразвуковом исследовании.
Лечение легкой степени СГЯ проводилось амбулаторно с применением малых объемов гипотонических жидкостей, таких как вода, сок и других легких напитков, а также трансфузии 6% рефортана 500,0 мл 1-2 раза.

Лечение СГЯ средней степени проводилось стационарно в гинекологическом отделении № 1 и отделении интенсивной терапии и реанимации ДРЦОМД. С целью восполнения ОЦК, возврата жидкости обратно в сосудистое русло, пациенткам вводились кристаллоидные растворы (физиологический раствор, раствор Рингера); коллоидные растворы (альбумин, гидроксиэтил крахмал); антигистаминные препараты; антикоагулянты. Одной пациентке был проведен сеанс плазмафереза. Пациенткам со средней степенью СГЯ была выполнена пункция брюшной полости, постановка катетера с целью выведения жидкости. После проведенного лечения мы наблюдали значительное клиническое улучшение, улучшение кровообращения и перфузии почек.

Первичную биохимическую диагностику беременности осуществляли на 14-й день после переноса эмбрионов путем определения концентрации ХГ в сыворотке крови. Последующую диагностику беременности (клиническую) проводили с помощью ультразвукового исследования на 21-й день после переноса эмбрионов. Ультразвуковое исследование сердцебиения плода, как правило, осуществляли при сроке беременности 4-5 недель.

Таким образом, эффективность лечения у 345 пациенток с трубной и трубно-перитонеальной формами бесплодия методом ЭКО и ПЭ составила 36,5% (126 женщин). В 2006 году уже родилось 20 (15,9%) детей.

Выводы
В ДРЦОМД согласно приказу № 579 МОЗ Украины проведено 345 циклов ЭКО и ПЭ. По возрасту пациентки распределились следующим образом: 19-25 лет - 78 (22,6%); 26-30 лет - 114 (33,0%); 31-35 лет - 124 (36,0%); 36-40 лет - 29 (8,4%). Средний возраст пациенток составил 31,3 года, длительность бесплодия - в среднем 7,6 года. По регионам данный вид лечения получили: АР Крым - 28 человек (8,1%); Днепропетровская область - 20 (5,7%); Донецкая область - 160 (46,3%); Запорожская область - 41 (11,8%); Луганская область - 18 (5,2%); Николаевская область - 13 (3,8%); Одесская область - 7 (2,0%); Полтавская область - 17 (4,8%); Сумская область - 7 (2,0%); Харьковская область - 12 (3,5%); Херсонская область - 13 (3,8%); Черкасская область - 4 (1,6%); г. Севастополь - 5 (1,4%). У 51 (14,8%) пролеченных нами женщин развился СГЯ. Из них: у 30 (8,7%) СГЯ легкой степени и у 21 (6,1%) СГЯ средней степени. Эффективность лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ составила 36,5% (126 женщин). В 2006 году уже родилось 20 (15,9%) детей.

(информация для пациентов, планирующих лечение бесплодия с применением методов вспомогательных репродуктивных технологий)

Вам предстоит лечение бесплодия с применением методов вспомогательных репродуктивных технологий. Вспомогательные репродуктивные технологии включают группу методов, позволяющих преодолеть бесплодие с помощью создания оптимальных условий для оплодотворения и зачатия внутри женского организма (контролируемая овариальная стимуляция (КОС) – применяется при изолированном ановуляторном бесплодии (отсутствии созревания и выхода яйцеклетки из яичника); инсеминация спермой мужа (ИОСМ) – при изолированном иммунологическом бесплодии (отрицательный посткоитальный тест) или легких степенях нарушения фертильности (способности к оплодотворению) у мужа), так и с «протезированием» функции оплодотворения (проведением оплодотворения вне организма, «в пробирке») : метод ЭКО и ПЭ (экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбриона в полость матки) – применяется при трубном и гормональном бесплодии у женщин и при умеренном нарушении фертильности у мужчин (при этом методе специально подготовленные сперматозоиды оплодотворяют яйцеклетку «в пробирке», однако сам механизм оплодотворения не отличается от естественного; метод ЭКО ИКСИ (экстракорпоральное оплодотворение путем микрохирургической клеточной технологии – ведения сперматозоида в яйцеклетку) – применяется при выраженных нарушениях фертильности у мужчин. В случае отсутствия сперматозоидов в семенной жидкости могут быть предложены методы хирургического забора сперматозоидов из яичка (TESA, PESA) или использование для оплодотворения криоконсервированной донорской спермы, в т. ч. ИОСД – искусственное осеменение спермой донора.
В настоящее время отсутствуют данные, доказывающие негативное влияние на потомство метода ЭКО. Любое негативное воздействие на половые клетки на этапе оплодотворения и раннего дробления имеет своим последствием для эмбриона (зародыша) закон «все или ничего»: эмбрион либо погибает, либо развивается без всяких последствий. Никакие «уродующие» влияния на организм на данной стадии развития эмбриона человека невозможны. Из этого не следует, что в результате программы ЭКО не могут родиться дети с пороками развития, проблемами со здоровьем – естественно могут, но вероятность рождения таких детей не превышает таковую в популяции и определяется не технологией оплодотворения, а наследственностью (вашей и вашего мужа), состоянием здоровья родителей ребенка, условиями их жизни и профессиональной деятельности, особенностями течения беременности и родов. Несколько по-иному обстоит дело с технологией ИКСИ, т.к. при производстве ИКСИ оплодотворяющий сперматозоид отбирается не путем естественного отбора, в силу чего образующийся эмбрион имеет больший риск генетических аномалий, что подтверждается на практике более высокой частотой выкидышей беременностей, полученных в результате ИКСИ. Кроме того, проведенные к настоящему времени исследования позволяют с достаточно высокой долей вероятности предполагать, что мальчики, рожденные в результате технологии ИКСИ, впоследствии в определенном проценте случаев будут нуждаться в ВРТ для реализации своей репродуктивной функции.
Эффективность процедур КОС и ИОСМ не превышает 18-20%. Эффективность процедуры ЭКО в классическом варианте составляет в настоящее время 30-35% и последние 10 лет принципиально не меняется. Под эффективностью понимают процент возникновения клинической (т.е.подтвержденной УЗИ) беременности у пациенток, у которых программа ЭКО была завершена полностью – т.е.закончилась переносом эмбриона в полость матки. В части получения (рождения) ребенка эффективность ЭКО составляет в настоящее время 18 – 20%. Связано это с тем, что приблизительно 25 – 30% беременностей, полученных в результате ЭКО, по разным причинам заканчиваются выкидышами. Кроме того, в ряде случаев в результате ЭКО может возникать внематочная беременность (вероятность возникновения внематочной беременности у пациенток ВРТ приблизительно в 4 раза выше, чем в общей популяции, причем, у данных пациенток внематочная беременность может возникать даже при отсутствии маточных труб). Крайне редко встречаются при ЭКО и другие аномальные формы зачатия, такие как трофобластическая болезнь (пузырный занос и хорионэпителиома). Однако,несмотря на невысокую эффективность, метод ЭКО является самым эффективным методом преодоления бесплодия на сегодняшний день, и эффективность его определяется не несовершенством технологии,а естественными закономерностями размножения человека: дело в том, что вероятность зачатия у человеческой пары в естественном менструальном цикле не превышает 25-30%, и определяется это законами генетики и механизмами естественного отбора. В процессе деления и оплодотворения в генетическом аппарате половых клеток могут происходить поломки – мутации, что приводит к образованию генетически неполноценного эмбриона. По данным литературы таких эмбрионов у здоровой пары может быть до 70%. Существующий механизм естественного отбора прекращает развитие таких эмбрионов либо на этапе имплантации (беременность не наступает), либо на ранних сроках беременности (в этом случае беременность может либо регрессировать, либо закончиться выкидышем (до 90 % выкидышей в первом триместре беременности имеют генетические причины). Поломка в механизмах естественного отбора ведет к рождению детей с аномалиями развития, хромосомными и генетическими заболеваниями
(б-нь Дауна и т.п.), однако, к счастью, происходит это очень редко (в тысячных долях процентов случаев). Именно «генетическим качеством» эмбриона и определяется эффективность или неэффективность программы ЭКО: при получении «генетически качественного» эмбриона беременность в программе ЭКО почти наверняка возникнет (вероятность такой ситуации 30-35%). При получении «генетически некачественного» эмбриона беременность не наступит ни при каких способах оптимизации программы (вероятность такой ситуации 65-70%). Небходимо помнить, что оценить «генетическое качество» эмбриона на сегодняшний день невозможно. Эмбриологи, ведущие программу ЭКО, оценивают качество эмбриона (существуют даже разные шкалы такой оценки), однако в основе такой оценки лежит не «генетическое качество» эмбриона, а скорость его дробления и наличие или отсутствие аномалий дробления (наличие или отсутствие фрагментации бластомеров – клеток, из которых состоит эмбрион). К сожалению, бывают ситуации, когда эмбрион с серьезными хромосомными или генетическими «поломками» на ранних стадия развитии (за которыми наблюдают эмбриологи в программе ЭКО) выглядит и развивается совершенно нормально, однако после переноса таких эмбрионов беременность невозможна.